¡Aquí estoy de nuevo! Esta última semana he realizado distintas prácticas, entre ellas la de microscopía óptica y la de electrónica, bueno también tuve que hacer la práctica de física (donde algún día maldeciréis con todas vuestras fuerzas hacer los cálculos para determinar el error en la medida), pero lo que más me llamó la atención fue lo complejo y lógico que es el proceso para poder observar al microscopio óptico correctamente y por ello me gustaría mostrároslo.
En pocas palabras, la microscopía
óptica se basa “simplemente” en aumentar nuestro poder de resolución[1], con el fin de apreciar con nitidez
imágenes que no podemos ver a simple vista, a través de un microscopio óptico,
que a su vez tiene su base en la luz y las lentes. Y digo “simplemente” porque
el acto de observar una muestra a pesar de parecer sencillo conlleva un proceso
complejo de preparación.
La muestra a
observar debe de:
-Ser lo suficientemente fina como para ser atravesada por la luz.
-Mantener su integridad estructural y química a lo largo del proceso.
1ª Etapa: Fijación.
Como estudiamos una muestra animal, tendremos que utilizar un fijador químico, nosotros utilizamos uno llamado “Bouin”[2],
este paso es tan crítico como importante, ya que ayuda a fijar las propiedades químicas de la muestra y a facilitarnos el manejo, pues la muestra adquiere una mejor consistencia.
Después de esperar entre uno y dos días podemos extraer la muestra, enjuagarla con agua y, por supuesto, trocearla adecuadamente.
2ª Etapa: Deshidratación.
Para realizar un corte de la muestra necesitaremos un soporte físico que nos sirva de andamio (ya que las muestras biológicas no suelen tener la consistencia suficiente para un corte demasiado fino) para ello utilizaremos parafina (es algo así como cera de vela) que no es
miscible en agua. Como consecuencia debemos deshidratar la muestra utilizando alcohol etílico (etanol).
3ªEtapa: Inclusión en parafina y tallado.
La
inclusión en parafina, se realiza a más de 45ºC, en concreto a una temperatura óptima de 60ºC. La parafina:sólida < 45ºC < líquida |
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La primera capa de parafina ha de estar al 50% de concentración de parafina y de xilol, en las sucesivas no es necesario.
La muestra se monta en unos moldes metálicos han de estar sobre una placa que los
caliente a 60ºC, donde la colocaremos lo más centrada posible y
comenzaremos a verter la parafina, volvemos a centrar la muestra y encajamos un
bloque de plástico con agujeros que nos
servirá de base, intentamos liberar las burbujas de aire entre los huecos y
dejamos enfriar.
Separamos la muestra del molde y realizamos cuatro marcas que delimiten la zona interesada, y con una hoja de bisturí retiramos la cera sobrante para evitar el pliegue y la fractura en el corte, este proceso se denomina “tallado”.
4ªEtapa: Cortado a máquina.
El corte se realiza en un microtomo, donde colocaremos
nuestra preparación y siguiendo los pasos de seguridad, acoplamos la cuchilla y
ajustamos la distancia para realizar cortes de 7 micras[4], y continuamos hasta obtener una muestra con
la suficiente calidad. Una vez tengamos la muestra cortada la pasamos a un
portaobjetos donde previamente hemos echado unas gotas de gelatina mientras
calienta en una placa.
5ª Etapa: Tinción.
La tinción es un paso muy importante en la microscopía
óptica ya que nos va a permitir diferenciar las distintas estructuras que
componen la célula.
En su mayoría, los productos de tinción son hidrofílicos,
por lo que necesitan de un medio hidratado para actuar. Con lo cual tenemos que
proceder a desparafinar y rehidratar nuestra muestra.
-Hematoxilina, que posee carácter básico, por lo que presenta una afinidad por los ácidos y se fijará a los ácidos nucleicos de la célula dándoles un color violeta.
-Eosina, con carácter ácido que se fijará a distintas estructuras confiriéndoles un tono rosado.
Una vez teñida la muestra, todavía nos queda un paso para poder apreciarla correctamente al microscopio, que es una nueva deshidratación, ya que el agua puede desviar nuestro haz de luz debido a la refracción[5] y nos puede mostrar una imagen distorsionada.
Después de la deshidratación se cubre la muestra con un cubreobjetos y una gota de pegamento.
6ª Etapa: observar la muestra a través del microscopio
Y después de todo este proceso lleno de hidrataciones y deshidrataciones nuestra muestra se verá en estos tonos según su naturaleza básica o ácida.
Además, estoy seguro de que podréis convencer a Fernando para que ponga un 10 a aquel alumn@ que me sepa responder estas 3 preguntas: ¿de qué tejido se trata?, ¿cuál es el nombre de la capa morada y la capa rosa inferior? y ¿qué es la banda rosita que se ve en la parte superior?
[1] Capacidad para ver dos puntos muy juntos como dos puntos separados.
[2] Mezcla de ácido acético, ácido pícrico y formaldehido.
[5] Refracción: efecto físico, en el que la luz cambia su dirección al pasar de un medio a otro con distinto índice de refracción (el cociente entre la velocidad de la luz en el vacío y en ese medio), según determina la Ley de Snell.
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2 comentarios:
Muy buena definición, te felicito
Estupenda reseña de la práctica...lo del diez no sé ;-)), quizá en un bachillerato todavía cueste si no das alguna pista....
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